Работы Погарской сигаретно-сигарной фабрики (ПССФ) в коллаборации с Дербентским коньячным комбинатом по созданию Русской сигары «Достоевскiй», представленной 27 октября 2023 года, проводились параллельно с научными исследованиями, в результате которых ПССФ получила патент на уникальный метод ферментации табачного сырья в этанолсодержащих средах.
По запросу наших читателей и учащихся Сигарной школы «Фумелье» Интернет-журнал CigarTime.ru с разрешения авторов публикует научные статьи по данной теме.
Ранее в интернет-журнале CIGARTIME.ru были опубликованы материалы «Алкогольная» ферментация табака в дубовых бочках» и «Алкогольная» ферментация табака в дубовых бочках. Часть 1. Массообмен танина и его косвенное количественное определение методом ВЭЖХ».
Предлагаем вашему вниманию вторую часть научной статьи, вышедшей в научном журнале НИУ ИТМО (Серия «Процессы и аппараты пищевых производств»).
Научная статья
УДК 663.97:543.544.5
«Алкогольная» ферментация табака в дубовых бочках.
Часть 2. Количественное изменение хлорогеновой кислоты и ее определение методом ВЭЖХ
Игорь Викторович Моисеев 1, Денис Александрович Карманов1, Валерий Владимирович Лёзный1, Дмитрий Владленович Бондаренко1, Григорий Петрович Синчин2
1 Погарская сигаретно-сигарная фабрика, Погар, Брянская область, Россия
2 Дербентский коньячный комбинат, Дербент, Республика Дагестан, Россия
Аннотация
Исследовали количественное изменение хлорогеновой кислоты (ХГК) в табачном сырье в процессе его ферментации в дубовых бочках в газо-жидкостной среде коньячного дистиллята в течение шести месяцев. Объектом изучения являлся кубинский сигарный табак сорта НР. Количественное определение ХГК проводили на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором методом внешнего стандарта в режиме градиентного элюирования. Внешний стандарт ХГК получали из зеленых зерен кофе экстракцией 40% водным раствором метанола с дальнейшей обработкой экстракта растворами Карреза и выпариванием обработанного экстракта на ротационном испарителе под вакуумом.
В результате хроматографирования внешнего стандарта получена хроматограмма в виде двойного пика. Для анализа исследуемых образцов табака предварительно подготовили их водно-метанольные экстракты по методу Сокслета. Показано, что массовая доля ХГК в неферментированном табачном сырье составила 0,29%, в ферментированном – 0,19%, что соответствует убыли ХГК за время ферментации на 42,9%. Для выявления возможной диффузии ХГК из табачного сырья в дубовую клепку проводили аналогичный анализ дубовой стружки толщиной 1 мм, срезанной с внутренней поверхности бочки до и после процесса ферментации.
Показано отсутствие ХГК в дубовой стружке, срезанной до ферментации табака. На хроматограмме экстракта дубовой стружки, срезанной после ферментации, обнаружен пик, соответствующий ХГК в количестве 0,047%. Однако его форма не позволяет однозначно утверждать, что данный пик непосредственно относится к ХГК.
Введение
Данная статья является продолжением исследований, направленных на изучение процесса «алкогольной» ферментации табачного сырья в дубовых бочках в газо-жидкостной среде коньячного дистиллята. Ранее авторами было изложено обоснование необходимости проведения вышеуказанных исследований и представлены экспериментальные данные по количественному массопереносу танина дуба в табачное сырье в течение 6 месяцев.
Это позволило определить степень насыщения табачного сырья высокомолекулярными полифенолами и на основании их химических свойств оценить изменение вкусоароматического профиля табачного дыма в зависимости от времени ферментации исследуемого табака. Однако в табаке содержатся собственные низкомолекулярные полифенолы, обладающие схожими с танином свойствами, содержание которых также может изменяться в процессе «алкогольной» ферментации.
В Nicotiana tabacum L. (табак обыкновенный) идентифицировано более 15 биологически активных низкомолекулярных полифенолов. Из этой группы веществ наибольший интерес представляет хлорогеновая кислота (ХГК) – депсид кофейной и хинной кислот. В связи с этим целью дополнительных исследований стало изучение количественного изменения ХГК в табачном сырье в процессе его «алкогольной» ферментации. При этом под термином «хлорогеновая кислота» подразумевается смесь трех основных изомерных форм, наиболее распространенных в природе: 3-кофеилхинной, 4-кофеилхинной и 5-кофеилхинной кислот.
Для достижения поставленной цели провели анализ научной литературы имеющихся методов количественного определения ХГК в растительных материалах, который выявил, что наиболее распространенными являются методы обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с использованием внешнего стандарта. Хроматография проводится в режиме градиентного элюирования с фотометрическим детектированием при длине волны 325 нм.
Характерной особенностью ХГК является легкое превращение одних изомерных форм в другие даже в процессе пробоподготовки, что, естественно, усложняет ее количественное определение.
Вдобавок производители высокочистых реактивов, такие как Merck, Sigma-Aldrich и Acros Organics в качестве реактива (внешнего стандарта) предлагают именно 5-кофеилхинную кислоту, что не дает возможности правильно оценить содержание ХГК в ходе анализа природных объектов. В связи с этим целесообразнее использовать естественную смесь изомеров, полученную экстракцией из растительного материала с высоким содержанием ХГК.
Наиболее подходящим растительным материалом для этих целей являются зерна зеленого кофе, содержание ХГК в которых достигает 14%. При этом наиболее простой и удобной окажется такая методика ВЭЖХ, которая будет определять все изомеры как одно единое вещество, т. е. на хроматограмме они будут идентифицироваться одним пиком.
Объекты и методы исследований
Объектом изучения, как и в предыдущей работе [1], стал кубинский (Ремедиос, Республика Куба) сигарный табак воздушной сушки (Dark air-cured, DAC) сорта НР урожая 2021 г., сферментированный в дубовой бочке из-под виноградного (коньячного) дистиллята 20-летней выдержки в течение шести месяцев. Хроматографический анализ исследуемых образцов на содержание ХГК проводили методом внешнего стандарта. Внешний стандарт ХГК получали из зеленых зерен кофе экстракцией водно-метанольным раствором с дальнейшим выпариванием экстракта до сухого продукта.
Методика получения стандартного образца ХГК.
Стандартный образец ХГК получали из зеленых кофейных зерен согласно методике. Зеленые кофейные зерна (Colombia Supremo) массой 5 г измельчали, заливали 60 см3 40%-м раствором метанола, настаивали смесь в течение суток при постоянном перемешивании и фильтровали. Для осаждения из экстракта белков и других высокомолекулярных соединений его обрабатывали двумя растворами Карреза.
Раствор Карреза № 1 готовили растворением 12,67 г K4[Fe(CN)6]·3H2O в дистилированной воде и доведением объема в мерной колбе до 100 см3 (0,3 М раствор). Раствор Карреза № 2 готовили растворением 21,95 г Zn(CH3COO)2·2H2O в дистилированной воде и доведением объема в мерной колбе до 100 см3 (1 М раствор). В водно-метанольный экстракт кофе добавляли по 10 см3 каждого из растворов. Смесь тщательно встряхивали и выдерживали в течение 10 мин. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Во избежание разложения (гидролиза) и изомеризации ХГК фильтрат испаряли до сухого продукта при пониженной температуре под вакуумом на ротационном испарителе ИР-1М3 (ПАО «Химлабоприбор», Россия) по технологическим параметрам, представленным в таблице 1.
Методика определения ХГК методом ВЭЖХ. Исходный стандартный раствор c концентрацией 1,6 г/дм3 готовили растворением навески стандартного образца ХГК массой 80 мг в мерной колбе на 50 см3. Определение ХГК проводилось на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США) со спектрофотометрическим детектором в обращенно-фазовом режиме градиентного элюирования. Условия хроматографирования представлены в таблице 2.
На рисунке 2 представлена хроматограмма стандартного образца ХГК в виде двойного пика со следующими хроматографическими характеристиками: время удерживания – 7,465 мин, интенсивность – 1158 мЕОП, площадь пика – 163,73 мЕОП·мин.
Двойная форма пика, по-видимому, обусловлена частичным разделением изомерных форм ХГК в процессе хроматографирования, что не вполне отвечает поставленной цели. Однако данная форма пика может служить дополнительным «маркером» для выявления ХГК в исследуемых образцах табака.
Отсутствие иных пиков на хроматограмме показывает, что полученный по вышеуказанной методике стандартный образец ХГК, не содержит других мешающих анализу примесей.
Результаты и обсуждение
Из навесок образцов табака массой 10,00 г получали водно-метанольные экстракты с дальнейшим их анализом на содержание ХГК. Экстрагирование осуществляли в аппарате Сокслета 40%-м раствором метанола объемом 250 см3 в течение 4 ч. Хроматограммы экстрактов табака представлены на рисунке 2, из анализа которого видно, что в табачных экстрактах ХГК четко идентифицируется в виде двойных пиков, схожих со стандартом.
Площадь пика на хроматограмме 1 составила 11,45 мЕОП·мин, на хроматограмме 2 – 6,54 мЕОП·мин, что соответствует массовой доле ХГК 0,28 и 0,16% для неферментированного и ферментированного табака соответственно. Следовательно, наблюдается убыль ХГК за время ферментации на 42,9%.
Уменьшение содержания ХГК в табаке в процессе «алкогольной» ферментации наиболее вероятно происходит вследствие ее окисления и гидролиза до хинной и кофейной кислот. Нельзя исключать и массоперенос ХГК из табачного сырья в дубовую клепку коньячной бочки. Поэтому для выявления возможной диффузии ХГК из табачного сырья в дубовую клепку проводили аналогичный анализ дубовой стружки толщиной 1 мм в количестве 10,00 г, срезанной с внутренней поверхности бочки до и после процесса ферментации. Хроматограммы экстрактов представлены на рисунке 3.
Анализ результатов хроматографии показал полное отсутствие ХГК в дубовой стружке, срезанной до ферментации табака в бочке. На хроматограмме экстракта дубовой стружки, срезанной после ферментации, обнаружен пик, соответствующий ХГК с площадью 1,93 мЕОП·мин, что соответствует массовой доле 0,047%. Однако его форма и малая интенсивность не позволяет однозначно утверждать, что данный пик непосредственно относится к ХГК. С большой долей вероятности пик может принадлежать какому-либо иному веществу, имеющему схожее время удерживания, и быть продуктом окисления вещества, идентифицированного на хроматограмме 1 (время удерживания ≈ 4,0–4,2 мин) и отсутствующего на хроматограмме 2.
Заключение
В целом результаты исследований подтверждают литературные данные об уменьшении содержания ХГК в растительном материале вследствие процессов ее окисления и гидролиза. Следовало ожидать и незначительный, а возможно, и полностью отсутствующий массоперенос ХГК из табака в дубовую клепку, так как табачный лист обладает более высокой сорбирующей способностью по отношению к насыщенной дистиллятом дубовой клепке. Следовательно, диффузия любых веществ из табака в дуб должна в значительной степени подавляться.
Однако одновременное увеличение содержания в табаке высокомолекулярных полифенолов (танина) и уменьшение низкомолекулярных (ХГК) в процессе «алкогольной» ферментации требуют особого планирования и расчета времени ферментации для получения наиболее качественного и сбалансированного по вкусоароматическим показателям продукта. Таким образом, проведенные исследования, несомненно, имеют практическое значение для табачной промышленности, где ферментация табака играет важную роль в создании продукции премиум-класса. Полученные результаты могут значительно обогатить технологию производства табачных изделий, позволяя специалистам объективно предсказать изменения потребительских качеств табачного сырья в процессе ферментации.
Литература
1. Моисеев И.В., Карманов Д.А., Лезный В.В., Бондаренко Д.В., Синчин Г.П. «Алкогольная» ферментация табака в дубовых бочках. Часть 1. Массообмен танина и его косвенное количественное определение методом ВЭЖХ // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия: Процессы и аппараты пищевых производств. 2024. № 2. С. 3–9. DOI: 10.17586/2310-1164-2024-17-2-3-9
2. Docheva M.H, Popova V.T., Ivanova T.A., Nikolova1 V.V., Hristeva T.H, Nikolov N.N. Polyphenol content and antioxidant activity of aqueous/methanol extracts from different tobacco species (Nicotiana). Bulgarian Chemical Communications. 2018. V. 50, Is. 4, pp. 553–559.
3. Дейнека В.И., Хлебников В.А., Сорокопудов В.Н., Анисимович И.П.. Хлорогеновая кислота плодов и листьев некоторых растений семейства Berberidaceae // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 57–61.
4. Тищенко Е.А., Цюпко Т.Г., Милевская В.В., Темердашев А.З. Идентификация и хроматографическое определение биоактивных компонентов в образцах растворимого кофе // Аналитика и контроль. 2017. Т. 21. № 3. С. 251–261. DOI: 10.15826/analitika.2017.21.3.008
5. Дейнека В.И, Олейниц Е.Ю., Блинова И.П., Дейнека Л.А. Селективность разделения изомерных хлорогеновых кислот в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журнал аналитической химии. 2019. Т. 74. № 8. С. 588–594. DOI: 10.1134/S004445021908005X
6. Блинова И.П., Олейниц Е.Ю., Саласина Я.Ю., Дейнека В.И., Ву Т.Н.А., Нгуен В.А. Одновременное определение хлорогеновых кислот и кофеина в кофе методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Известия высших учебных заведений. Серия: Химия и химическая технология. 2023. Т. 66. № 2. С. 45–52. DOI: 10.6060/ivkkt.20236602.6711.
7. Xie C., Yu K., Zhong D., Yuan T., Ye F., Jarrell J.A., Millar A., Chen X. Investigation of isomeric transformations of chlorogenic acid in buffers and biological matrixes by ultraperformance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole/ion mobility/orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011, V. 59, no. 20, pp. 11078–11087. DOI: 10.1021/jf203104k
8. Clifford M.N., Kirkpatrick J., Kuhnert N., Roozendaal H., Salgado P.R. LC-MSn analysis of the cis isomers of chlorogenic acids. Food Chemistry. 2008, V. 106, Is. 1, pp. 379–385. DOI: 10.1016/j.foodchem.2007.05.081
9. Farah A., Donangelo C.M. Phenolic compounds in coffee. Brazilian Journal of Plant Physiology. 2006, V. 18, no. 1, pp. 23–36. DOI: 10.1590/S1677-04202006000100003
10. Шамилов А.А., Бубенчикова В.Н., Гарсия Е.Р., Ибаева Х.А., Ларский М.В. Разработка и валидация методики количественного определения фенольных соединений и хлорогеновой кислоты в голубики болотной листьях // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2022. Т. 25. № 2. С. 14–23. DOI: 10.29296/25877313-2022-02-03
11. Farah A., Paulis T., Trugo L.C., Martin P.R. Effect of roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005, V. 53, no. 5, pp. 1505–1513. DOI: 10.1021/jf048701t
12. Куликова Н.Е., Чернобровина А.Г., Роева Н.Н., Попова О.Ю. Исследование процесса выпаривания для получения концентратов из растительного сырья // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 2. С. 335–346. DOI: 10.21603/2074-9414-2023-2-2438
13. Федоренко Б.Н., Бородулин Д.М., Просин М.Д., Шафрай А.В., Лобасенко Б.А., Головачева Я.С. Определение рациональных технологических параметров работы экстрактора Сокслета при получении спиртовой настойки из ягод клюквы // Техника и технологии пищевых производств. 2020. Т. 50. № 1. С. 115–123. DOI: 10.21603/2074-9414-2020-1-115-123
14. Моисеев И.В., Карманов Д.А., Лезный В.В., Кириллов Д.Д. Исследование количественного изменения никотина в табачном сырье в процессе естественной ферментации под прессом // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия: Процессы и аппараты пищевых производств. 2022. № 4. С. 25–30. DOI: 10.17586/2310-1164-2022-15-4-25-30
15. Gil M., Wianowska D. Chlorogenic acids – their properties, occurrence and analysis. Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, sectio AA – Chemia. 2017, V. 72, no. 1, pp. 61–104. DOI: 10.17951/aa.2017.72.1.61
БУДЬТЕ ПЕРВЫМИ! ВСЕ АНОНСЫ ПУБЛИКАЦИЙ — НА НАШЕМ TELEGRAM КАНАЛЕ
